Użytkownik "Cezary Zekanowski" <c...@w...com.pl> napisał w wiadomości
news:9qcb8o$48v$1@pippin.nask.waw.pl...

> Nie robiono tego analiza sprzezen? Na jakiej więc podstawie wykluczono
> zwiazek z CFTR?

Postaram sie to wyjasnic na przykladzie. Jesli masz rodzine z dwojka chorych
dzieci o identycznych objawach choroby, i jesli badanie markerow
wewnatrzgenowych i flankujacych wykaze, ze nie odziedziczyly one tych samych
genow CFTR od swoich rodzicow, to oznacza to, ze choroba w tej konkretnej
rodzinie nie jest sprzezona z CFTR. Natomiast zadna analiza sprzezen w tej
jednej rodzinie nie umozliwi identyfikacji genu odpowiedzialnego za
chorobe. Do tego potrzeba znacznie wiekszej liczby rodzin (zeby mozliwe bylo
uzyskanie wynikow statystycznie istotnych), przy zalozeniu, ze badana grupa
stanowi w miare jednorodna grupe (tzn., ze tylko jeden gen, inny niz CFTR,
jest odpowiedzilany za chorobe w tych rodzinach).

> Co rozumiesz przez dodatkwa
> przeslanke wynikajaca z proporcji?

Sprobuje to wyjasnic na kolejnym przykladzie. Jesli w grupie z CF
identyfikuje sie (sekwencjonowaniem eksonow) 50% zmutowanych allelow, to
jesli wszystkie te analizowane przypadki choroby sa wynikiem mutacji w CFTR,
nalezaloby oczekiwac, ze 25% pacjentow bedzie miala zidentyfikowane dwie
mutacje, 50% jedna mutacje, i 25% zadnej (zgodnie z prawem H-W). Jesli
jednak z obserwacji wynika, ze rozklad tych zidentyfikowanych mutacji jest
inny, n.p. ze 40% ma dwie mutacje, 20% jedna mutacje, i 40% zadnej, to
oznacza najprawdopodobniej, ze grupa bez zadnej mutacji obejmuje sporo
przypadkow, w ktorych choroba ma przyczyne inna niz CFTR (alternatywnie,
mozna zalozyc, ze jest to jakis specyficzny typ mutacji w CFTR, ktory
powoduje chorobe w ukladzie homozygotycznym, ale nie w przypadku
heterozygoty zlozonej, co jest bardzo trudne do wytlumaczenia na poziomie
molekularnym, i w zwiazku z tym malo prawdopodobne). Co wiecej, na podstawie
tych danych mozna w przyblizeniu obliczyc, jaka czesc pacjentow bez zadnej
mutacji, stanowia ci, ktorych choroba nie jest skutkiem defektu w CFTR.
Musimy tylko dodac wtedy jedno zalozenie, ze wszyscy pacjenci, u ktorych
zidentyfikowano jedna mutacje w CFTR, maja takze inna mutacje w tym genie
(ktorej nie da sie wykryc sekwencjonowaniem eksonow) - to zalozenie dziala
oczywiscie "na niekorzysc" ew. przypadkow non-CFTR (o czym nalezy pozniej
pamietac). Poczatkowo, nie wiadomo wiec ilu pacjentow z niewykryta mutacja
ma dwie mutacje w CFTR (a nie w innym genie), ale na podstawie porownania
czestosci pacjentow z jedna wykryta mutacja i dwiema, mozna postarac sie
obliczyc, ilu nalezaloby sie spodziewac pacjentow, ktorzy posiadaja dwie
niewykryte mutacje w CFTR.

Z podanych w przykladzie liczb wynika, ze obserwujemy dwa razy wiecej
"homozygot" (z dwiema mutacjami) niz "heterozygot" (z jedna mutacja) - w
tym wypadku traktujemy wszystkie zidentyfikowane mutacje jako jeden tzw.
"wykrywalny" allel, a pozostale mutacje w CFTR jako drugi allel -
"niewykrywalny". Czestosc homozygot to p^2, gdzie p oznacza czestosc allelu
"wykrywalnego", natomiast czestosc heterozygot to 2pq, gdzie q jest
czestoscia "niewykrywalnych" allelow w CFTR (oczywiscie p+q=1). Mozemy wiec
zbudowac uklad rownan z dwoma niewiadomymi:

p^2 = 2(2pq)
p + q = 1

Rozwiazanie brzmi nastepujaco:
p = 0,8
q = 0,2

Czyli takie powinne byc czestosci obu typow allelow, gdybysmy wykluczyli
pacjentow, ktorzy nie posiadaja zadnej (wykrywalnej czy niewykrywalnej)
mutacji w CFTR.

Dane na temat czestosci genotypow, ktore przedstawilem powyzej, podane sa w
procentach, ale zalozmy, ze odpowiadaja one konkretnym liczbom, tzn. ze 40%
to 40 pacjentow, a calkowita liczba badanych pacjentow wynosi 100. Z
obliczonych przeze mnie wartosci p i q, wynika, jaki powinien byc stosunek
heterozygot (o genotypie wykrywalna/niewykrywalna) do homozygot z allelami
niewykrywalnymi (ktorych czestosc wynosic powinna q^2). Poniewaz 2pq wynosi
0,32, a q^2 = 0,04, to oznacza to, ze nalezy sie spodziewac osiem razy mniej
owych "niewykrywalnych homozygot", niz "heterozgot", ktorych bylo 20
przypadkow. Czyli oczekiwana liczba "niewykrywalnych homozygot" wynosi 2,5
(2-3). Tymczasem, tych pacjentow, u ktorych nie wykryto zadnej mutacji, bylo
az 40, co oznacza ze prawdopodobnie ok. 37-38 z nich (ponad 90%) cierpi na
chorobe nie bedaca wynikiem mutacji w CFTR. Liczba ta moze byc jeszcze
wieksza, jesli zalozymy, ze nie wszyscy pacjenci z jedna zidentyfikowana
mutacja musza miec druga mutacje w CFTR, oraz ze nie wszystkie niewykrywalne
mutacje w ukladzie homozygotycznym prowadza do wystapienia choroby
(Wszystkie liczby tu podane sa wartosciami przykladowymi nie majacymi nic
wspolnego z rzeczywistymi wynikami)

Zdaje sobie sprawe z tego, ze powyzsze obliczenia moga wydawac sie bardzo
zagmatwane tym osobom, ktore spotykaja sie z takimi szacunkami po raz
pierwszy, dlatego prosilbym tych, ktorzy potrafia przesledzic tok
przedstawionego rozumowania, o opinie w kwestii poprawnosci tych kalkulacji
(licze szczegolnie na Pawla Porebe).

> Jezeli dysponujesz tekstem pracki z
> przyjemnoscia bym sie z nia zapoznal.

Niestety nie, ale abstrakt zawierajacy wyniki wstepnych badan
(przedstawionych na ubieglorocznym zjezdzie Polnocnoamerykanskiego
Towarzystwa CF) byl opublikowany w specjalnym (corocznym) dodatku do
Pediatric Pulmonology.

> Nie. Ja sie pytalem jakie sa czastkowe koszty (ile odczynniki, ile
robocizna
> etc) badania dla osoby z ulicy, dla ktorej podobno to kosztuje 150 zl.

Nie znam Czarku tych wszystkich czastkowych kosztow. Z tego, co sie
orientuje, to robocizna stanowi ok. 60 % kosztow ogolnych po odliczeniu
kosztow odczynnikow, ktore prawie na pewno nie przkraczaja 10% calej sumy
(mysle, ze jest to ok. 10 zl). Reszta idzie na pozostale rzeczy (a wiec
prad,
koszty utrzymania budynkow, amortyzacja sprzetu, no i zapewne takze tzw.
"zysk", bo odbywa sie to w tym wypadku na zasadach komercyjnych).

Wg
> moich obliczen odczynniki (wybieralem dobrych firm, nie najtansze)
kosztuja
> ponizej 5 zlotych na jedna probke.

Mysle, ze troche wiecej (ok. 10-15 zl.?). Duzo zalezy od tego, ile badan sie
wykonuje. W przesiewie wyjdzie taniej (ale tylko jesli bedzie to bardzo duza
liczba probek, a na to sie nie zanosi), ale robiac taki test komercyjnie dla
czlowieka z ulicy musisz liczyc sie z tym, ze mozesz byc czasem zmuszony
robic taka analize dla jednej tylko osoby, co oznacza robienie jednego PCRu,
jednego zelu, jednej elektroforezy i jednego zdjecia dla jednej tylko
probki, zamiast powiedzmy dziesieciu, czy kilkunastu (to samo zreszta
dotyczy niektorych sytuacji w przesiewie, zlaszcza jesli zalezy nam na
szybkiej diagnozie). A wiec koszty materialow i robocizny w przeliczeniu na
probke ulegaja wtedy zwielokrotnieniu.

> Oczywiscie nie uwzgledniam robocizny,
> pradu, amortyzacji etc - ale nie przesadzajmy. Albo gdzies sie bardzo myle
> (bede wdzieczny za pokazanie gdzie), albo cena jest wzieta z sufitu.

Chyba przesadzasz. Gdyby cena byla az tak zawyzona, to widac by to bylo przy
porownaniu z cenami w innych osrodkach, a tymczasem wychodzi na to, ze IMiD
robi to wyjatkowo tanio. Jesli chodzi np. o robocizne, to zalozmy, ze przy
cenie 150 zl wynosi ona mniej wiecej 70-80 zl, co obejmuje nie tylko
izolacje DNA z bibuly, wykonanie PCRu, elektroforeze PAGE, wybarwienie zelu,
zrobienie zdjecia i interpretacje wyniku, ale takze rzeczy o ktorych na ogol
sie nie pamieta, a wiec cala robote papierkowa (korespondencja z pacjentem
badz lekarzem prowadzacym), zaaranzowanie spotkania z pacjentem, pobranie
krwi przez wykwalifikowana pielegniarke, wprowadzenie wszystkich informacji
do bazy danych, wydanie wynikow, itp. Sam test genetyczny nie jest
zautomatyzowany i wymaga sporych umiejetnosci manualnych. Zakladajac, ze
robocizna stanowi 60-80% kosztow podobnego testu w USA, mozna szacowac, ze
Polacy za taka sama prace (i tej samej jakosci - co wazne) dostaja ok. 3-4
razy mniej pieniedzy.

> Koszty badan swiatowych - przede wszystkim te dokladne z Toronto tez mnie
> troche niepokoja, nie bardzo potrafie podliczyc jak np. PAGE kosztuje
25.6
> dolarow kanadyjskich (na probke, czyli 7 sciezek?).

Niestety, tez do konca tego nie rozumiem. Ale warto tutaj zauwazyc, ze sama
izolacja DNA z krwi pacjenta kosztuje tam 48 dol. kanad. (ok. 130 zl), czyli
niemal tyle, ile cala analiza mutacji (lacznie z izolacja DNA) u nas.

> Dla porownania: koszt testu immunologicznego anty-HIV dla osoby z ulicy
jest
> ok. 45 zlotych. Skomplikowanie techniczne nie jest mniejsze (w porownaniu
z
> delF508), a odpowiedzialnosc bez watpienia wieksza.

Co do odpowiedzialnosci, zgoda, ale jak ja przeliczyc na pieniadze?
Jesli chodzi o skomplikowanie techniczne, to nie jestem pewien. Taki test
immunologiczny jest, jak podejrzewam, rodzajem testu plytkowego, ktory mozna
w znacznym stopniu zautomatyzowac, a wiec obnizyc zdecydowanie koszty. W
przypadku del508 jest to niemozliwe (jesli mowimy o tescie w jego obecnej
postaci).

> Pytanie, jak cena 150 zł odbija sie przesiewie, moze stad nie zostalo do
> przesiewu wlaczone przynajmniej 5 mutacji?

Nie mozna tego w taki prosty sposob porownywac. Test paskowy na wieksza
liczbe mutacji jest tanszy, jesli przeliczyc go na jedna mutacje.
Przykladowo, wykonanie testu na 12 mutacji (w tym delF508) kosztuje u nas
280 zl, a wiece cena jednej mutacji wynosilaby tutaj ok. 23 zl. Tak wiec
test na
wieksza liczbe mutacji jest drozszy ogolnie, ale tanszy zdecydowanie w
przeliczeniu na jedna mutacje. Problem w projekcie pilotazowym byl jak
podejrzewam taki, ze testy na dwie najczestsze (po delF508) mutacje w
populacji polskiej musialy byc wykonywane oddzielnie (co oczywiscie pokaznie
zwiekszalo koszty), a na dodatek trzeba bylo dodatkowo pobierac krew od
dziecka.

> Faktycznie - 5 mutacji o ktorych mowilem daja taka czestosc jak sama
delF508
> w Szwecji (posluguje sie wynikami badam z grupy PRM).

Mowiles nawet, ze czestosc pieciu mutacji w Polsce przekracza 80%, tylko jak
dotad nie podales zadnych przykladow i konkretnych liczb.

> Jesli chodzi o meritum dyskusji, to widze, ze bez otwartej publikacji
> wynikow dotychczasowego przesiewu nie da sie prowadzic rozsadnej rozmowy.

Zgadzam sie.

Pozdrawiam,

Michal